(1) Somma di: Delta-5-23-Stigmastadienolo + Clerosterolo + Sitosterolo + Sitostanolo + Delta-5-Avenasterolo + Delta-5-24 Stigmastadienolo).
Nota:
I risultati delle analisi devono essere espressi con un numero di decimali uguale a quello previsto per ogni caratteristica.
L'ultima cifra deve essere aumentata di una unit� se la cifra successiva � maggiore di 4.
E' sufficiente che una sola caratteristica non sia conforme ai valori indicati perch� l'olio venga cambiato di categoria o dichiarato non conforme riguardo la sua purezza.".
3) � aggiunto il seguente allegato XVIII:
"ALLEGATO XVIII
DETERMINAZIONE DEI TRIACILGLICEROLI CON ECN 42 (DIFFERENZE FRA I DATI HPLC E IL CONTENUTO TEORICO)
1. Campo di applicazione
Determinazione della composizione dei triacilgliceroli (TAG) contenuti negli oli d'oliva, in funzione del loro numero di carbonio equivalente, per differenza fra i risultati analitici ottenuti per cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC) e il contenuto teorico, calcolato a partire dalla composizione in acidi grassi.
2. Campo di applicazione
La norma � applicabile agli oli d'oliva. Il metodo � applicabile alla rivelazione della presenza di piccole quantit� di oli di semi (ricchi in acido linoleico) in qualunque categoria di oli d'oliva.
3. Principio
Per gli oli puri, il contenuto in triacilgliceroli con ECN 42, determinato per HPLC, corrisponde in una certa misura al contenuto teorico in triacilgliceroli con ECN 42, calcolato in base alla determinazione per GLC della composizione in acidi grassi. Una differenza superiore ai valori stabiliti nel regolamento per ciascun olio indica che l'olio contiene oli di semi.
4. Metodo
Il metodo fondato sul calcolo del contenuto teorico di triacilgliceroli con ECN 42 e sulla differenza fra i dati HPLC e quelli teorici si basa essenzialmente sulla coordinazione dei dati analitici ottenuti mediante altri metodi. � possibile distinguere tre stadi: determinazione della composizione in acidi grassi per gascromatografia capillare, calcolo della composizione teorica dei triacilgliceroli con ECN 42, determinazione HPLC dei triacilgliceroli con ECN 42.
4.1. Apparecchiatura
4.1.1. Palloni a fondo arrotondato da 250 a 500 ml.
4.1.2. Beakers da 100 ml.
4.1.3. Colonna cromatografica in vetro (diametro interno: 21 mm, lunghezza 450 mm), provvista di cono normalizzato (femmina) alla sommit� e di rubinetto.
4.1.4. Imbuti separatori da 250 ml con cono normalizzato (maschio) al fondo, adatto al collegamento con la sommit� della colonna.
4.1.5. Bacchetta di vetro, lunghezza 600 mm.
4.1.6. Imbuto di vetro, diametro 80 mm.
4.1.7. Matracci volumetrici, 50 ml.
4.1.8. Matracci volumetrici, 20 ml.
4.1.9. Evaporatore rotativo.
4.1.10. Cromatografo in fase liquida ad alta prestazione, che permetta il controllo termostatico della temperatura della colonna.
4.1.11. Iniettore capace di erogare dosi da 10�l.
4.1.12. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilit� a fondo scala dev'essere pari almeno a 10-4 unit� dell'indice di rifrazione.
4.1.13. Colonna: tubo in acciaio inossidabile della lunghezza di 250 mm e del diametro interno di 4,5 mm, riempito con particelle del diametro di 5 �m di silice contenente il 22-23 % di carbonio sotto forma di ottadecilsilano (nota 2).
4.1.14. Registratore e/o integratore.
4.2. Reattivi
I reattivi debbono essere di purezza analitica.
I solventi di eluizione debbono essere degassati e possono essere riciclati pi� volte senza effetti sulle separazioni.
4.2.1. Etere di petrolio 40-60 �C, qualit� per cromatografia.
4.2.2. Etere etilico, esente da perossidi, distillato di fresco.
4.2.3. Solvente per eluizione cromatografica: miscela etere di petrolio/etere etilico 87/13 (v/v).
4.2.4. Gel di silice, 70-230, tipo Merck 7734, con un contenuto d'acqua standardizzato al 5 % (m/m).
4.2.5. Lana de vetro.
4.2.6. Acetone.
4.2.7. Acetonitrile.
4.2.8. Solvente per eluizione HPLC: acetonitrile + acetone (proporzioni da regolare in modo da ottenere la separazione desiderata: cominciare con una miscela 50:50).
4.2.9. Solvente di solubilizzazione: acetone.
4.2.10. Trigliceridi di riferimento: si possono usare i trigliceridi del commercio (tripalmitina, trioleina, ecc.), riportando su un grafico i rispettivi tempi di ritenzione in funzione del numero di carbonio equivalente, oppure utilizzare cromatogrammi di riferimento ottenuti impiegando olio di soia, miscele 30:70 olio di soia-olio di oliva e olio di oliva puro (vedi note 3 e 4 e figure 1, 2, 3, 4).
4.3. Preparazione del campione
Poich� un certo numero di sostanze capaci di interferire pu� dar luogo a risultati falsamente positivi, il campione dev'essere sempre purificato secondo il metodo IUPAC 2.507 (determinazione delle sostanze polari negli oli Preparazione della colonna cromatografica
4.3.1. Preparazione della colonna cromatografica
Riempire la colonna (4.1.3) con 30 ml circa di solvente di eluizione (4.2.3), introducendo poi nella colonna un poco di lana di vetro (4.2.5), spingendola al fondo della colonna mediante la bacchetta di vetro (4.1.5).
In un Beakers da 100 ml, sospendere 25 g di gel di silice (4.2.4) in 80 ml di miscela di eluizione (4.2.3), trasferendola quindi nella colonna mediante un imbuto di vetro (4.1.6).
Per assicurare il completo trasferimento del gel di silice nella colonna, lavare il Beakers con la miscela di eluizione e trasferire nella colonna anche le porzioni di lavaggio.
Aprire il rubinetto e lasciar eluire il solvente dalla colonna fin quando il suo livello superi di circa 1 cm quello del gel di silice.
4.3.2. Cromatografia su colonna
In un matraccio tarato da 50 ml (4.1.7), pesare, con la precisione di 0,001 g, 2,5 � 0,1 g di olio previamente filtrato, omogeneizzato e se necessario disidratato.
Disciogliere in 20 ml circa di solvente di eluizione (4.2.3), se necessario riscaldando leggermente per facilitare la dissoluzione. Raffreddare a temperatura ambiente e portare a volume col solvente di eluizione.
Con una pipetta volumetrica, introdurre 20 ml di soluzione all'interno della colonna preparata come al punto 4.3.1, aprire il rubinetto e lasciar defluire il solvente fino al livello dello strato di gel di silice.
Eluire con 150 ml di solvente di eluizione (4.2.3), regolando la velocit� di passaggio del solvente a 2 ml/min. circa (per passare attraverso la colonna, 150 ml impiegheranno 60-70 minuti circa).
Recuperare l'eluato in un matraccio a fondo arrotondato da 250 ml (4.1.1), precedentemente tarato in stufa e pesato con esattezza. Eliminare il solvente sotto depressione (Rotavapor) e pesare il residuo che verr� impiegato per preparare la soluzione per l'analisi HPLC e per la preparazione dell'estere metilico.
Il recupero del campione dalla colonna non dovr� essere inferiore al 90 % per le categorie olio extravergine, olio vergine, olio corrente, olio raffinato e olio d'oliva, ed all'80 % per l'olio lampante e per l'olio di sansa.
4.4. Analisi HPLC
4.4.1. Preparazione dei campioni per l'analisi cromatografica
Preparare una soluzione del 5 % del campione da analizzare pesando 0,5 � 0,001 g del campione in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con il solvente di solubilizzazione (4.2.9).
4.4.2. Procedimento
Montare il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (4.2.8) alla portata di 1,5 ml/min, in modo da spurgare l'intero sistema. Attendere finch� la linea di base sia stabile. Iniettare 10 �l del campione preparato come indicato in 4.3.
4.4.3. Calcolo ed espressione dei risultati
Impiegare il metodo di normalizzazione, vale a dire ammettere che la somma della aree dei picchi corrispondenti ai TAG da ECN 42 ad ECN 52 sia uguale al 100 %. Calcolare la percentuale relativa di ciascun trigliceride impiegando la formula:
% di trigliceride = area del picco � 100/somma delle aree dei picchi.
I risultati debbono essere espressi con almeno due cifre decimali.
Nota 1: L'ordine di eluizione pu� essere determinato calcolando i numeri di carbonio equivalente, definiti spesso dalla relazione ECN = CN-2n, dove CN � il numero di carbonio ed n � il numero di doppi legami, esso pu� essere calcolato precisamente tenendo conto dell'origine del doppio legame. Se n�, nl e nln sono i numeri di doppi legami attribuiti rispettivamente agli acidi oleico, linoleico e linolenico, il numero di carbonio equivalente pu� essere calcolato mediante la relazione data dalla formula:

ECN = CN - d�n� - dlnl - dlnnln

dove i coefficienti d�, dl e dln possono essere calcolati mediante i trigliceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente metodo, la relazione ottenuta sar� vicina a:

ECN = CN - (2,60 n�) - (2,35 nl) - (2,17 nln)

Nota 2: Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere o equivalente (Merck) 100 CH18 Art 50377
Nota 3: con diversi trigliceridi di riferimento � anche possibile calcolare la risoluzione rispetto alla trioleina:

a = RT ' / RT trioleina

impiegando il tempo corretto di ritenzione RT ' = RT - RT solvente.
Il grafico di log a in funzione di f (numero di doppi legami) permette di determinare i valori di ritenzione per tutti i trigliceridi degli acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento (cfr. figura 2).
Nota 4: l'efficienza della colonna dovrebbe permettere una chiara separazione del picco della trilinoleina da quelle dei trigliceridi con un RT immediatamente prossimo. L'eluizione viene effettuata fino al picco corrispondente ad ECN 52.
Nota 5: una misura corretta delle aree di tutti i picchi aventi interesse per la presente determinazione � assicurata quando l'altezza del secondo picco della serie ECN 50 � pari al 50 % del fondo scala di registrazione.
4.5. Calcolo della composizione in triacilgliceroli (moli %) dai dati GLC relativi agli acidi grassi
4.5.1. Determinazione della composizione in acidi grassi. La composizione in acidi grassi viene determinata secondo il metodo gascromatografico CEE riportato nell'allegato X A del regolamento (CEE) n. 2568/91, mediante una colonna capillare. La preparazione degli esteri metilici viene eseguita conformemente all'allegato X B (soluzione alcolica di sodio metilato).
4.5.2. Acidi grassi per il calcolo
I gliceridi sono raggruppati secondo i loro numeri di carbonio equivalente (ECN), tenendo conto delle equivalenze fra ECN ed acidi grassi riportate qui di seguito. Sono stati presi in considerazione soltanto gli acidi grassi con 16 e 18 atomi di carbonio, poich� sono i soli che abbiano importanza per l'olio d'oliva.