ALLEGATO Xb"
Allegato Xb
Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi in conformit� all'allegato VI - punti I e II - del regolamento (CEE) n. 72/77 della commissione oppure in alternativa il metodo seguentePREMESSA
La scelta del procedimento da seguire deve essere fatta in funzione della composizione acidica e dell'acidit� della sostanza grassa da esaminare e della analisi gascromatografica da effettuare.
In particolare:
- per sostanze grasse contenenti acidi grassi inferiori a C12, possono essere impiegati solo i procedimenti in fiala chiusa o al solfato dimetilico;
- per sostanze grasse aventi acidit� superiore al 3 % possono essere impiegati solo i procedimenti al metanolo-acido cloridrico o al solfato di metilico;
- per determinazioni gascromatografiche di isomeri trans possono essere impiegati solo i procedimenti al metilato sodico o al solfato dimetilico;
- il procedimento al metanolo-esano-acido solforico deve essere impiegato per la preparazione degli esteri metilici di piccole quantit� di sostanze grasse da separazioni per cromatografia su strato sottile. La presenza di insaponificabile pu� essere trascurata purch� non superi il 3 %, altrimenti gli esteri metilici dovranno essere preparati dagli acidi grassi.
Sono descritti cinque procedimenti per la preparazione degli esteri metilici da sostanze grasse:
a) con metilato sodico
b) con metilato sodico in fiala chiusa
c) con metanolo-acido cloridrico in fiala chiusa
d) con solfato dimetilico
e) con metanolo-esano-acido solforico.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con alcool metilico e metilato sodico. Gli esteri metilici ottenuti sono estratti con etere etilico.
3. APPARECCHIATURA
- 3.1. Pallone da 100 ml con refrigerante a ricadere, munito all'estremit� superiore di tubo a calce sodata, con giunti a smeriglio.
- 3.2. Cilindri graduati da 50 ml.
- 3.3. Pipetta graduata da 5 ml, con divisioni in 0,1 ml.
- 3.4. Imbuti separatori da 250 ml.
- 3.5. Pallone da 200 ml.
- 4.1. Metanolo anidro.
- 4.2. Metilato sodico, soluzione all'1 % circa in metanolo; si prepara sciogliendo 0,34 g di sodio metallico in 100 ml di metanolo anidro.
- 4.3. Etere etilico.
- 4.4. Sodio cloruro, soluzione 10 %.
- 4.5. Etere di petrolio 40-60�C.
- 5.1. Nel pallone da 100 ml si introducono 2 g di sostanza grassa previamente disidratata su solfato sodico e filtrata. Si aggiungono 35 ml di metanolo, si congiunge il refrigerante e si fa bollire a ricadere per alcuni minuti.
- 5.2. Si interrompe il riscaldamento, si stacca il refrigerante e si aggiungono rapidamente 3,5 ml di soluzione di metilato sodico; si collega nuovamente il refrigerante e si fa bollire a riflusso per almeno 3 ore. La metilazione deve ritenersi completa quando tutta la sostanza grassa � passata in soluzione e la miscela di reazione � perfettamente limpida a temperatura ambiente.
- 5.3. Si raffredda e si versa la miscela di reazione in un imbuto separatore da 250 ml, si aggiungono 35-40 ml di etere etilico, 100 ml di acqua e 5-6 ml di
soluzione di cloruro sodico al 10 %. Si agita e si lasciano separare gli strati; la fase acquosa viene trasferita in un secondo imbuto separatore ed estratta nuovamente con 25 ml
di etere etilico.Agli estratti eterei, riuniti, si aggiungono 50 ml di etere di petrolio 40-60�C; ci� provoca la separazione di acqua che viene eliminata. Si lava la fase eterea
per 3 volta con porzioni di 10-15 ml di acqua, si essicca su solfato sodico e si filtra su carta raccogliendo il filtrato nel pallone da 200 ml. Si distilla il solvente,
completandone l'allontanamento su bagnomaria in corrente di azoto puro.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene trattata con metilato sodico in soluzione metanolica, in fiala chiusa, a 85-90�C.
3. APPARECCHIATURA
- 3.1. Fiala di vetro a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro 14-16 mm).
- 3.2. Pipetta graduata da 1 ml con divisioni in 0,1 ml.
- 4.1. Metilato sodico, soluzione all'1,5 % circa in metanolo. Si prepara sciogliendo 0,50 g di sodio metallico in 100 ml di metanolo anidro.
- 5.1. Nella fiala di vetro si introducono 2 g di sostanza grassa, previamente disidratata su solfato sodico e filtrata. Si aggiungono 0,3 g (circa 0,4 ml) di soluzione di metilato sodico e si chiude la fiala alla fiamma.
- 5.2. Si mantiene la fiala per 2 ore in bagno a 85-90�C agitando di tanto in tanto; l'avvenuta esterificazione si rileva dalla limpidezza del contenuto della fiala dopo sedimentazione della glicerina e del residuo dei reagenti.
- 5.3. Si raffredda a temperatura ambiente. Si apre la fiala al momento dell'impiego degli esteri metilici. Questi non richiedono altre manipolazioni prima dell'introduzione nel gascromatografo.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene trattata con metanolo-acido cloridrico, in fiala chiusa, a 100�C.
3. APPARECCHIATURA
- 3.1. Fiala di vetro, a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro 14-16 mm).
- 3.2. Pipette tarate da 1 e 2 ml.
- 4.1. Soluzione di acido cloridrico in metanolo al 2 %. Si prepara con acido cloridrico gassoso e metanolo anidro (Nota 1).
- 4.2. Esano per gascromatografia.
- 5.1. Si introducono nella fiala di vetro 0,2 g di sostanza grassa, preventivamente disidratata su solfato sodico e filtrata, e 2 ml di soluzione di acido cloridrico-metanolo. Si chiude la fiala alla fiamma.
- 5.2. Si mantiene la fiala in bagno a 100�C per 40 minuti.
- 5.3. Si raffredda la fiala sotto acqua corrente, si apre, si aggiungono 2 ml di acqua distillata e 1 ml di esano. Si centrifuga e si preleva la fase esanica che � pronta per l'impiego.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene saponificata con soluzione metilalcolica di potassio idrossido, quindi trattata con solfato dimetilico. Dopo aggiunta di acido cloridrico, si ha separazione spontanea degli esteri metilici formatisi. Mediante successivo trattamento con allumina, si ottengono esteri metilici ad elevata purezza.
3. APPARECCHIATURA
- 3.1. Provetta di vetro, a pareti robuste, capacit� circa 20 ml, con tappo smerigliato 10/19, con ganci di sicurezza.
- 3.2. Refrigeranti a ricadere a 5 bolle, attacco a smeriglio 10/19.
- 3.3. Filtri di vetro a setto poroso gradazione G 2, diametro 20 mm.
- 3.4. Provette di vetro, capacit� circa 10 ml, fondo conico.
- 3.5. Siringhe da 1 ml e 5 ml.
- 4.1. Potassio idrossido, soluzione al 10 % in alcool metilico per gascromatografia.
- 4.2. Indicatore verde di bromocresolo: soluzione allo 0,05 % in alcool metilico.
- 4.3. Solfato dimetilico (d = 1,335 a 15�C).
- 4.4. Acido cloridrico concentrato, d 1,19, diluito 1 + 1 con alcool metilico per gascromatografia.
- 4.5. Ossido di alluminio standardizzato secondo Brockmann per cromatografia di assorbimento.
- 5.1. Si introducono nella provetta da 20 ml. (circa 2,2 ml) di sostanza grassa preventivamente disidratata su solfato sodico e filtrata, si aggiungono 5 ml della soluzione di potassio idrossido e alcuni granuli di quarzo per regolare l'ebollizione. Si applica il refrigerante a ricadere e si riscalda su piccola fiamma per 5 minuti agitando: la saponificazione risulta comunque completa quando la soluzione � limpida. Al termine, si raffredda con acqua corrente e si stacca il refrigerante.
- 5.2. Si aggiungono 2 gocce di indicatore e, mediante siringa, 1 ml di solfato dimetilico, lentamente. Si chiude ermeticamente la provetta e si agita 2-3 minuti, immergendo frequentemente il fondo della provetta in b.m. bollente: la reazione � completa quando l'indicatore vira dal blu al giallo. Al termine, si raffredda la provetta sotto acqua corrente, quindi si apre e si aggiungono 5 ml della soluzione metanolica di acido cloridrico.
- 5.3. Dopo agitazione per alcuni secondi, si pone la provetta in posizione inclinata quindi si imprimono ad essa delle leggere scosse che facilitano l'affioramento
degli esteri metilici sotto forma di massa oleosa (Nota A). Si prelevano gli esteri metilici mediante siringa, si introducono in una provetta a fondo conico, si aggiunge un
volume di allumina pari a circa 1/4 del volume degli esteri metilici, si agita e si filtra su carta.
Nota A: Nel caso non si abbia separazione spontanea degli esteri metilici, aggiungere nella provetta 5 ml di acqua ed agitare.
2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con metanolo-esano-acido solforico. Gli esteri metilici ottenuti sono estratti con etere di petrolio.
3. APPARECCHIATURA
- 3.1. Provetta da 20 ml circa, munita di refrigerante a ricadere ad aria, della lunghezza di 1 m circa, con giunti a smeriglio.
- 3.2. Pipetta tarata da 5 ml.
- 3.3. Imbuto separatore da 50 ml.
- 3.4. Cilindri graduati da 10 e 25 ml.
- 3.5. Provetta da 15 ml, a fondo conico.
- 4.1. Reagente di metilazione: metanolo anidro-esano-acido solforico concentrato (d 1,84) in rapporto 75:25:1 (V/V/V).
- 4.2. Etere di petrolio 40-60�C.
- 4.3. Sodio solfato anidro.
- 5.1. Nella provetta da 20 ml si introduce il materiale recuperato dalla placca e si aggiungono 5 ml di reagente di metilazione.
- 5.2. Si collega il refrigerante a ricadere e si riscalda per 30 minuti in bagnomaria bollente (Nota 2).
- 5.3. Si trasferisce quantitativamente la miscela in un imbuto separatore da 50 ml, aiutandosi con 10 ml di acqua distillata e 10 ml di etere di petrolio. Si agita
vigorosamente, si lasciano separare le fasi, si allontana lo strato acquoso e si lava lo strato etereo per due volte con 20 ml di acqua distillata. Si aggiunge nell'imbuto
separatore una piccola quantit� di solfato sodico anidro, si agita, si lascia a riposo per qualche minuto e si filtra, raccogliendo il filtrato in una provetta a fondo conica da
15 ml. Si evapora il solvente su bagnomaria, in corrente di azoto.
Nota 1: � possibile preparare facilmente in laboratorio piccole quantit� d'acido cloridrico gassoso, modificando la soluzione disponibile in commercio (r= 1,18) aggiungendo qualche goccia d'acido solforico concentrato (r= 1,84). Il gas liberato pu� facilmente essere seccato se viene fatto gorgogliare nell'acido solforico concentrato. Poich� l'acido cloridrico � rapidamente assorbito dal metanolo, si raccomanda di prendere le precauzioni abituali al momento della dissoluzione, ad esempio introducendo il gas con una piccola fiala rovesciata il cui bordo sfiora la superficie del liquido. La soluzione metanolica d'acido cloridrico pu� essere preparata in anticipo in grandi quantit�, poich� si conserva perfettamente in bottiglie con tappo di vetro conservate nell'oscurit�.
Nota 2: Per controllare l'ebollizione introdurre una bacchetta di vetro nella provetta e limitare la temperatura del bagnomaria a 90�C.
