ALLEGATO VII"

Allegato VII

Determinazione degli acidi grassi in posizione 2 nel trigliceride

1. OGGETTO
Si tratta di un metodo per la determinazione della composizione di quella frazione degli acidi grassi di un olio o di un grasso che viene esterificata nella posizione 2 (oppure posizione interna) del glicerolo.

2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo � applicabile agli oli e ai grassi aventi un punto di fusione inferiore ai 45�C, a causa delle caratteristiche dell'azione della lipasi pancreatica. Esso non si pu� applicare indiscriminatamente agli oli e ai grassi contenenti quantitativi sostanziali di: acidi grassi con 12 atomi di carbonio o meno (oli di noci di cocco e di semi di palma, grasso butirrico), o acidi grassi insaturi (con oltre quattro doppi legami) contenenti 20 o pi� atomi di carbonio (oli di pesce e di animali marini), oppure acidi grassi contenenti gruppi ossigenati diversi dal gruppo acido.

3. PRINCIPIO
Eventuale neutralizzazione di oli e grassi acidi in un solvente. Purificazione filtrando attraverso una colonna di allumina. Idrolisi parziale dei trigliceridi a opera della lipasi pancreatica in un periodo determinato. Separazione dei monogliceridi formatisi mediante cromatografia su strato sottile e metanolisi degli stessi. Analisi di questi esteri metilici mediante cromatografia gas-liquido.

4. APPARECCHIATURA

• 4.1. Pallone a fondo arrotondato, da 100 ml.
• 4.2. Pallone a fondo arrotondato, da 25 ml, con giunto smerigliato.
• 4.3. Condensatore ad aria, di 1 m di lunghezza, idoneo ad essere montato sul pallone a 4.2.
• 4.4. Beuta da 250 ml.
• 4.5. Bicchiere da 50 ml.
• 4.6. Imbuto separatore da 500 ml.
• 4.7. Colonna di vetro per cromatografia, avente un diametro interno di 13 mm, una lunghezza di 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto.
• 4.8. Provetta da centrifuga di 10 ml, provvista di tappo di vetro smerigliato.
• 4.9. Buretta da 5 ml, graduata in 0,05 ml.
• 4.10. Siringa ipodermica da 1 ml, provvista di ago sottile.
• 4.11. Microsiringa, idonea a rilasciare gocce di 3-4 �l.
• 4.12. Diffusore per cromatografia su strato sottile.
• 4.13. Piastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 20 * 20 cm.
• 4.14. Vaschetta di sviluppo in vetro per cromatografia su strato sottile, con coperchio a smeriglio, idoneo per le piastre 20 * 20.
• 4.15. Spray per cromatografia su strato sottile.
• 4.16. Stufa regolata a 103 � 2�C.
• 4.17. Termostato regolabile tra 30 e 45�C con un'approssimazione di 0,5�C.
• 4.18. Evaporatore rotante.
• 4.19. Vibratore elettrico, che consenta un'agitazione vigorosa delle provette da centrifuga.
• 4.20. Lampada a ultravioletto per l'esame delle piastre di strato sottile.
  
  Inoltre, per il controllo dell'attivit� della lipasi:
  
• 4.21. pH metro.
• 4.22. Agitatore a spirale.
• 4.23. Buretta da 5 ml.
• 4.24. Cronometro.
  
  Inoltre, per l'eventuale preparazione della lipasi:
  
• 4.25. Agitatore da laboratorio, idoneo per la dispersione e la miscela di materiali eterogenei.
  
  

5. REAGENTI

• 5.1. n-esano oppure, in mancanza di quest'ultimo, etere di petrolio (p. eb. 30-50�C), di qualit� per cromatografia.
• 5.2. 2-propanolo, oppure etanolo, al 95 % (V/V), di qualit� per reagente analitico.
• 5.3. 2-propanolo, oppure etanolo, soluzione acquosa 1/1.
• 5.4. Etere etilico, esente da perossidi.
• 5.5. Acetone.
• 5.6. Acido formico, almeno al 98 % (m/m).
• 5.7. Solvente di sviluppo: miscela di n-esano (5.1), etere etilico (5.4) ed acido formico (5.6) in proporzioni 70/30/1 (V/V/V).
• 5.8. Allumina attivata per cromatografia, neutra, grado Brockmann I.
• 5.9. Polvere di silice, con legante, di qualit� idonea alla cromatografia su strato sottile.
• 5.10. Lipasi pancreatica di qualit� adeguata (nota 1, nota 2).
• 5.11. Idrossido di sodio, soluzione acquosa di 120 g/l.
• 5.13. Cloruro di calcio (CaCl2), soluzione acquosa di 220 g/l.
• 5.14. Colato di sodio (qualit� enzimatica), soluzione acquosa di 1 g/l.
• 5.15. Soluzione tampone: soluzione acquosa 1 M di tris-idrossimetilamminometano, portata a pH 8 mediante aggiunta di acido cloridrico (5.12) (controllare col potenziometro).
• 5.16. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95 % (V/V).
• 5.17. 2', 7' -diclorofluoresceina, soluzione di 2 g/l in etanolo al 95 % (V/V), resa leggermente alcalina mediante aggiunta di 1 goccia di soluzione di idrossido di sodio 1 N per 100 ml.
  
  Inoltre, per il controllo dell'attivit� lipasica:
  
• 5.18. Olio neutralizzato.
• 5.19. Idrossido di sodio, soluzione acquosa 0,1 N.
• 5.20. Colato di sodio (qualit� enzimatica), soluzione acquosa di 200 g/l.
• 5.21. Gomma arabica, soluzione acquosa di 100 g/l.
  
  

6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Se il campione ha un'acidit� inferiore al 3 %, determinata conformemente all'allegato II, purificare direttamente su allumina conformemente al punto 6.2. Se il campione ha un'acidit� superiore al 3 %, determinata conformemente all'allegato II, neutralizzare con alcali in presenza di un solvente conformemente al punto 6.1, quindi passare su allumina conformemente al punto 6.2.

• 6.1. Neutralizzazione con alcali in presenza di solvente.
  In un imbuto separatore (4.6) introdurre circa 10 g dell'olio grezzo e aggiungere 100 ml di esano (5.1), 50 ml di 2-propanolo (5.2), poche gocce di soluzione di fenolftaleina (5.16) e un quantitativo di soluzione di idrossido di sodio (5.11) corrispondente all'acidit� libera dell'olio, oltre a uno 0,3 % in eccesso. Agitare vigorosamente per 1 minuto, aggiungere 50 ml di acqua distillata, agitare di nuovo e lasciar riposare. Dopo la separazione, rimuovere lo strato di sapone che si trova sul fondo. Rimuovere altres� eventuali strati intermedi (mucillagine, sostanza insolubile). Lavare la soluzione di esano dell'olio neutralizzato con successive porzioni da 25-30 ml della soluzione di 2-propanolo (5.3) finch� il colore rosa della fenolftaleina scompare. Eliminare la maggior parte dell'esano mediante distillazione sotto vuoto nell'evaporatore rotante (4.18), essiccare l'olio a 30-40�C sotto vuoto con l'ausilio di una corrente di azoto puro finch� l'esano � stato completamente rimosso.
• 6.2. Purificazione mediante allumina.
  Preparare una sospensione di 15 g di allumina attivata (5.8) in 50 ml di esano (5.1) e versarla, agitando, sulla colonna cromatografica (4.7). Lasciare che l'allumina si depositi uniformemente e che il solvente scenda ad 1-2 mm sopra l'assorbente. Versare cautamente sulla colonna una soluzione di 5 g di olio in 25 ml di esano (5.1); raccogliere la totalit� dell'effluente dalla colonna in un pallone a fondo arrotondato (4.1).

7. PREPARAZIONE DELLE PIASTRE CROMATOGRAFICHE
Pulire accuratamente le piastre di vetro (4.13) con etanolo, etere di petrolio ed acetone per eliminare qualsiasi traccia di sostanza grassa. In una beuta (4.4) versare 30 g di polvere di silice (5.9). Aggiungere 60 ml di acqua distillata. Tappare ed agitare fortemente per 1 minuto. Trasferire immediatamente l'impasto nel diffusore (4.12) e coprire le piastre pulite con uno strato di 0,25 mm.
Essiccare le piastre all'aria per 15 minuti e successivamente per un'ora nella stufa (4.16) a 103 � 2�C. Raffreddare le piastre in un essiccatore a temperatura ambiente prima dell'uso. Sono disponibili in commercio piastre preparate.

8. PROCEDIMENTO

• 8.1. Idrolisi con lipasi pancreatica.
  In una provetta da centrifuga (4.8) pesare circa 0,1 g del campione preparato: se si tratta di grasso solido, si scioglie con 0,2 ml di esano (5.1), scaldando leggermente se necessario. Aggiungere 20 mg di lipasi (5.10) e 2 ml della soluzione tampone (5.15). Agitare energicamente, ma con cautela e aggiungere successivamente 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (5.14) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio (5.13). Chiudere la provetta con il tappo smerigliato, agitare con cautela (evitare di bagnare il tappo), inserire la provetta immediatamente nel termostato (4.17) mantenuto a 40 � 0,5�C ed agitare manualmente esattamente 1 minuto. Togliere la provetta dal termostato ed agitare vigorosamente mediante agitatore elettrico (4.19) esattamente 2 minuti. Raffreddare immediatamente in acqua corrente; aggiungere 1 ml di acido cloridrico (5.12) ed 1 ml di etere etilico (5.4). Tappare e agitare vigorosamente mediante l'agitatore elettrico. Lasciar riposare e rimuovere lo strato organico per mezzo della siringa (4.10), se necessario dopo aver centrifugato.
• 8.2. Separazione dei monogliceridi mediante cromatografia su strato sottile.
  Applicare l'estratto sulla piastra cromatografica con la microsiringa (4.11), a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, in una linea sottile, uniforme, il pi� stretta possibile. Sistemare la piastra nella vaschetta di sviluppo ben saturata (4.14) e sviluppare col solvente di sviluppo (5.7) a circa 20�C, fino a circa 1 cm dal bordo superiore della piastra. Essiccare la piastra all'aria alla temperatura della vaschetta e spruzzare con la soluzione di 2', 7' -diclorofluoresceina (5.17). Identificare la banda del monogliceride (Rf circa 0,035) sotto luce ultravioletta (4.20).
  
• 8.3. Analisi dei monogliceridi mediante cromatografia gas-liquido.
  Rimuovere la banda ottenuta al punto 8.2 mediante una spatola (evitare di rimuovere i componenti che restano sulla linea di base) e trasferire nel pallone di metilazione (4.2). Trattare la silice raccolta direttamente come descritto all'allegato X-B alternativo in modo da trasformare i monogliceridi in esteri metilici ed esaminare quindi gli esteri mediante gascromatografia come descritto all'allegato X-A.
  
  

9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Calcolare la composizione dell'acido grasso nella posizione 2 con una decimale (nota 3).

10. NOTE

• Nota 1: Controllo dell'attivit� della lipasi
  Preparare una emulsione oleosa agitando una miscela di 165 ml della soluzione di gomma arabica (5.21), 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio neutralizzato (5.18) in un agitatore adeguato. In un bicchiere (4.5) versare 10 ml di questa emulsione, seguiti da 0,3 ml della soluzione di colato di sodio (5.20) e 20 ml di acqua distillata. Sistemare il bicchiere in un termostato mantenuto a 37 � 0,5�C (nota 4); inserire gli elettrodi di un pHmetro (4.21) e un agitatore a spirale (4.22). Mediante una buretta (4.23) aggiungere goccia a goccia la soluzione di idrossido di sodio (5.19) fino a pH 8,5. Aggiungere un quantitativo sufficiente di una sospensione acquosa della lipasi (vedasi sotto). Non appena il pHmetro indica un pH di 8,3, avviare il cronometro (4.24) e farvi gocciolare la soluzione di idrossido di sodio (5.19) in modo da mantenere il pH a 8,3. Leggere il volume di soluzione alcalina consumata ogni minuto. Registrare le osservazioni sotto forma di grafico, indicando le letture di tempo nelle ascisse e i ml di soluzione alcalina necessari per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un grafico lineare. La sospensione di lipasi di cui sopra � una sospensione in acqua all'1 per mille (m/m). Per ciascuna prova dev'essere usato un quantitativo sufficiente di questa sospensione in modo che venga consumato in 4 o 5 minuti circa 1 ml della soluzione alcalina. Di solito sono necessari da 1 a 5 mg della polvere. L'unit� di lipasi viene definita come il quantitativo di enzima che libera 10 �-equivalenti di acido per minuto. Pertanto l'attivit� A della polvere usata, misurata in unit� di lipasi per mg, � indicata dalla formula seguente:

  Nota 1 / A = (V * 10) / m

  dove V � il numero della soluzione di idrossido di sodio (5.19) consumato per minuto, desunto dal grafico;
  m � la massa, in mg, dell'aliquota della polvere da analizzare.
• Nota 2: Preparazione della lipasi
  Sono disponibili in commercio lipasi aventi un'attivit� lipasica soddisfacente. Tuttavia � possibile prepararle in laboratorio come segue: Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0�C; rimuovere il grasso solido circostante e il tessuto connettivo e triturare in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Mescolare questa pasta con l'agitatore (4.25) per 4-6 ore con 2,5 l di acetone anidro e centrifugare. Esterarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela 1/1 (V/V) di acetone e di etere etilico e due volte con etere etilico. Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero.
• Nota 3: In ogni caso � consigliabile determinare la composizione degli acidi grassi totali dello stesso campione, dato che il confronto con quelli degli acidi nella posizione 2 contribuir� all'interpretazione dei dati ottenuti.
  
• Nota 4: La temperatura di idrolisi � fissata a 37�C, dato che si usa un olio liquido. Tuttavia essa viene fissata a 40�C per il campione da analizzare, in modo da consentire l'esame di grassi aventi punti di fusione superiori a 45�C.