• 3.1. Beuta da 25 ml.
• 3.2. Colonna in vetro per cromatografia avente diametro interno 15,0 mm e altezza 30-40 cm.
• 3.3. Gascromatografo adeguato con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da:
  • 3.3.1. Forno a termostato per le colonne, idoneo a mantenere la temperatura desiderata con la precisione di � 1 �C.
  • 3.3.2. Iniettore a freddo per introduzione diretta in colonna.
  • 3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.
  • 3.3.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non superiore a 1 s, e con velocit� della carta variabile.
  • 3.3.5. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 10-15 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 �m.
• 3.4. Microsiringa per on-column da 10 �l con ago cementato.

• 4.1. Gel di silice 70-230 mesh art. 7754 Merck. Il gel di silice � posto in muffola a 500 �C per 4 h. Dopo raffreddamento � addizionato del 2 % di acqua. Si agita bene allo scopo di omogeneizzare la massa. Si conserva al buio almeno per 12 h prima del suo impiego.
• 4.2. n-Esano, per cromatografia.
• 4.3. Etere etilico, per cromatografia.
• 4.4. n-Eptano, per cromatografia.
• 4.5. Soluzione campione di lauril arachidato, allo 0,1 % (m/v) in esano (standard interno).
• 4.6. Gas vettore: idrogeno, puro per gascromatografia.
• 4.7. Gas ausiliari:
  - idrogeno, puro per gascromatografia;
  - aria, pura per gascromatografia.

• 5.1. Separazione della frazione delle cere.
  • 5.1.1. Mettere in sospensione 15 g di gel di silice idratato al 2 % in n-esano anidro e introdurli nella colonna. Dopo assestamento spontaneo si completa lo stesso mediante l'uso di un vibratore elettrico per rendere pi� omogeneo il letto cromatografico. Si percolano 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze.
  • 5.1.2. Conduzione della cromatografia su colonna. Nella beuta da 25 ml si pesano esattamente circa 500 mg di campione, si addiziona dell'opportuna quantit� di standard interno, in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio si aggiungono 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva e 0,25-0,50 mg nel caso di olio di sansa. Il campione cos� preparato viene trasferito nella colonna cromatografica preparata come a
  • 5.1.1. aiutandosi con due porzioni da 2 ml cadauna di n-esano. Si lascia fluire il solvente fino ad un battente di 1 mm. A questo punto inizia l'eluizione cromatografica raccogliendo 140 ml di miscela n-esano/etere-etilico nel rapporto 99: 1, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 s (2,1 ml/min). La frazione cos� ottenuta viene evaporata mediante evaporatore rotante sino quasi a secchezza, si allontanano gli ultimi 2 o 3 ml con l'aiuto di un debole flusso di azoto e si riprende il tutto con 10 ml di n-eptano.
• 5.2. Analisi gascromatografica.
  • 5.2.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.
    • 5.2.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso connesso col sistema on column, e il terminale di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.).
    • 5.2.1.2. Se la colonna � messa in uso per la prima volta � consigliabile procedere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 �C superiore a quella di esercizio (nota). Si mantiene tale temperatura per almeno 2 h, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico, regolazione della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore, ecc.) e si registra il segnale ad una sensibilit� almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.
      Nota: La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 �C alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato.
  • 5.2.2. Scelta delle condizioni operative.
    • 5.2.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:
      - temperatura della colonna: inizio a 80 �C, quindi incremento di 30 �C/min fino a 120 �C, poi programmata di 5 �C/min fino a 340 �C;
      - temperatura del rilevatore: 350 �C;
      - velocit� lineare del gas di trasporto: idrogeno 20-35 cm/s;
      - sensibilit� strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima;
      - sensibilit� di registrazione: 1-2 mV fondo scala;
      - velocit� della carta: 30 cm/h;
      - quantit� di sostanza iniettata: 0,5-1 �l di soluzione.
      Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo (in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti: il tempo di ritenzione dello standard interno C32 deve essere 25 � 2 min e il picco delle cere pi� rappresentativo deve essere contenuto tra il 60 e il 100 % fondo scala).
    • 5.2.2.2. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.
  • 5.2.3. Esecuzione dell'analisi.
    • 5.2.3.1. Con la microsiringa da 10 �l si preleva 1 �l di soluzione; si alza lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso il dispositivo di iniezione e dopo 1-2 s si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 s.
    • 5.2.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione delle cere. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.2.1.2).
  • 5.2.4. Identificazione dei picchi L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni. Nella fig. 1 � riportato un cromatogramma delle cere di un olio di oliva vergine.
  • 5.2.5. Valutazione quantitativa.
    • 5.2.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore delle aree dei picchi dello standard interno e degli esteri alifatici da C40 a C46.
    • 5.2.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo estere, in mg/kg di sostanza grassa come segue:

      singolo estere (mg/kg) = (Ax . ms . 100) / (As . m )

      dove:
      Ax = area del picco del singolo estere;
      As = area del picco del lauril arachidato;
      ms = massa di lauril arachidato aggiunta, in milligrammi;
      m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi.

K = Km 0,5 (Km 4 + Km+4)