ALLEGATO IX"

Allegato IX

Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto

1. PREMESSA
L'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto pu� fornire indicazioni sulla qualit� di una sostanza grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte da processi tecnologici. Gli assorbimenti alle lunghezze d'onda previste nel metodo sono dovuti alla presenza di sistemi dienici e trienici coniugati. I valori di tali assorbimenti sono espressi come estinzione specifica E 1 % 1 cm (estinzione di una soluzione della sostanza grassa all'1 % nel solvente prescritto, in spessore di 1 cm) convenzionalmente indicata con K, (detto anche coefficiente di estinzione).

2. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per l'esecuzione dell'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto delle sostanze grasse.

3. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa in esame viene disciolta nel solvente richiesto, quindi si determina l'estinzione della soluzione alle lunghezze d'onda prescritte, in riferimento al solvente puro. Dalle letture spettrofotometriche si calcolano le estinzioni specifiche.

4. APPARECCHIATURA

• 4.1. Spettrofotometro per misure di estinzione nell'ultravioletto fra 220 e 360 nm, con possibilit� di lettura per ogni unit� nanometrica.
• 4.2. Vaschette di quarzo prismatiche, con coperchio, di percorso ottico da 1 cm. Le vaschette, riempite di acqua o altro solvente idoneo, non devono presentare fra di loro differenze superiori a 0,01 unit� di estinzione.
• 4.3. Matracci tarati da 25 ml.
• 4.4. Colonna per cromatografia, avente lunghezza 450 mm e diametro 35 mm, con tubo di deflusso del diametro di circa 10 mm.
  
  

5. REAGENTI

• 5.1. Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 60 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm;
  
  oppure
  - Cicloesano spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 40 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm
  
  oppure
  - altro solvente idoneo, atto ad ottenere la completa solubilizzazione della sostanza grassa (es. alcool etilico per l'olio di ricino).
• 5.2. Allumina basica per cromatografia su colonna, preparata e controllata come descritto in Appendice I.
• 5.3. n-Esano, per cromatografia.
  
  

6. PROCEDIMENTO

• 6.1. Il campione in esame deve essere perfettamente omogeneo ed esente da impurezze sospese. Gli oli liquidi a temperatura ambiente si filtrano su carta alla temperatura di circa 30�C, i grassi concreti vengono omogeneizzati e filtrati a temperatura superiore di non oltre 10�C alla temperatura di fusione.
• 6.2. Del campione cos� preparato si pesano esattamente circa 0,25 g in matraccio tarato da 25 ml, si porta a volume con il solvente prescritto e si omogeneizza. La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida. Qualora si riscontri opalescenza o torbidit� si filtra rapidamente su carta.
• 6.3. Con la soluzione ottenuta si riempie una vaschetta e si misurano le estinzioni, usando come riferimento il solvente impiegato, alle lunghezze d'onda significative comprese fra 232 e 276 nm. I valori di estinzione letti devono essere compresi nell'intervallo 0,1 � 0,8; in caso contrario � necessario ripetere le misure operando con soluzioni opportunamente pi� concentrate o pi� diluite.
• 6.4. Qualora sia richiesta la determinazione dell'estinzione specifica dopo passaggio su allumina si procede nel seguente modo: nella colonna cromatografica si introducono 30 g di allumina basica in sospensione in esano; dopo assestamento dell'adsorbente si elimina l'eccesso di esano, sino ad 1 cm circa al disopra del livello superiore dell'allumina. Si sciolgono 10 g di sostanza grassa, omogeneizzata e filtrata come descritto in 5.1., in 100 ml di esano e si versa tale soluzione in colonna. Si raccoglie l'eluato e si evapora totalmente il solvente sotto vuoto ad una temperatura inferiore ai 25�C. Sulla sostanza grassa cos� ottenuta si procede immediatamente come detto in 5.2.
  
  

7. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

• 7.1. Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie lunghezze d'onda calcolate come segue:
  

  Kl = El  / (c * s)

  in cui:
  Kl = estinzione specifica alla lunghezza d'onda l,
  El = estinzione misurata alla lunghezza d'onda �,
  c = concentrazione della soluzione in g/100 ml,
  s = spessore della vaschetta in cm.
  
  I risultati si esprimono con due cifre decimali.
  
• 7.2. L'esame spettrofotometrico dell'olio di oliva secondo il metodo ufficiale dei Regolamenti della CEE prevede la determinazione dell'estinzione specifica, in soluzione in isoottano, alle lunghezze d'onda di 232 e 270 nm e la determinazione del DK inteso come:
  

  D K = Km - (Km - 4 + Km + 4) / 2

  in cui Km � l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda m, lunghezza d'onda di massimo assorbimento intorno a 270 nm.
  
  

APPENDICE I
Preparazione dell'allumina e controllo dell'attivit�.

• A1.1. Preparazione dell'allumina
  In un recipiente a chiusura ermetica si pone l'allumina preventivamente essiccata in forno a 380-400�C per 3 ore, si aggiunge acqua distillata in ragione di 5 ml per 100 g di allumina, si chiude subito il recipiente, si agita ripetutamente, quindi si lascia a riposo per almeno 12 ore prima dell'uso.
• A1.2. Controllo dell'attivit� dell'allumina.
  Si prepara una colonna cromatografica con 30 g di allumina. Operando come descritto al paragrafo 5.4. si fa passare attraverso la colonna una miscela costituita da:
  - 95 % olio di oliva vergine, avente estinzione specifica a 268 nm inferiore a 0,18;
  - 5 % olio di arachide trattato con terre nel processo di raffinazione, avente estinzione specifica a 268 nm uguale o superiore a 4.
  Se la miscela dopo passaggio in colonna presenta estinzione specifica a 268 nm superiore a 0,11 l'allumina � accettabile, altrimenti deve essere aumentato il tasso di idratazione.
  
  

APPENDICE II
Taratura dello spettrofotometro A2.
L'apparecchio deve essere controllato periodicamente (almeno ogni 6 mesi) sia per la rispondenza della lunghezza d'onda che per l'esattezza della risposta.

• A2.1. Il controllo della lunghezza d'onda pu� essere fatto mediante la lampada a vapori di mercurio o mediante gli appositi filtri.
• A2.2. Per il controllo della risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore si procede come segue: si pesano 0,2000 g di potassio cromato puro per spettrofotometria e si sciolgono, in matraccio tarato da 1 000 ml, in soluzione di idrossido di potassio 0,05 N diluendo poi a volume. Della soluzione ottenuta si prelevano 25 ml esatti, si trasferiscono in matraccio tarato da 500 ml e si diluisce ulteriormente a volume con la stessa soluzione di idrossido di potassio. Della soluzione cos� ottenuta si misura l'estinzione a 275 nm, impiegando la soluzione di idrossido di potassio come riferimento. L'estinzione misurata con vaschetta da 1 cm dovr� essere 0,200 � 0,005.