ALLEGATO VIII"

Allegato VIII

Determinazione del convenuto di trilinoleina

1. OGGETTO
Si tratta di un metodo di separazione e determinazione quantitativa della composizione di trigliceridi degli oli vegetali a seconda del loro peso molecolare e grado di insaturazione, in funzione del rispettivo numero di carbonio equivalente (vedi nota 1).

2. CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente metodo si applica a tutti gli oli vegetali contenenti trigliceridi di acidi grassi a catena lunga. Il metodo si applica soprattutto per individuare la presenza di piccoli quantitativi di oli semisiccativi (ricchi di acido linoleico) in oli vegetali contenenti acido oleico come acido grasso insaturo predominante, quale l'olio d'oliva.

3. PRINCIPIO
Separazione di trigliceridi, a seconda del loro numero di carbonio equivalente, mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni (polarit� di fase inversa) ed interpretazione dei cromatogrammi.

4. APPARECCHIATURA

• 4.1. Cromatografo liquido ad alte prestazioni, che consente un controllo termostatico della temperatura della colonna.
• 4.2. Unit� di iniezione da 10 �l.
• 4.3. Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilit� su tutta la scala non deve essere inferiore a 10-4 unit� di indice di rifrazione.
• 4.4. Colonna: tubo in acciaio inossidabile da 250 mm di lunghezza e 4,5 mm di diametro interno, riempito di particelle di silice aventi un diametro di 5 �m, con il 22-23 % di carbonio sotto forma di octadecilsilano (nota 2).
• 4.5. Registratore e/o integratore.
  
  

5. REAGENTI
I reagenti devono essere di purezza per analisi. I solventi di eluizione devono essere degassati e possono essere riciclati parecchie volte senza ripercussioni sulle separazioni.

• 5.1. Cloroformio.
• 5.2. Acetone.
• 5.3. Acetonitrile.
• 5.4. Solvente di eluizione: Acetonitrile + acetone (proporzioni da modificare in modo da ottenere la separazione desiderata; cominciare con miscela 50 : 50).
• 5.5. Solvente di solubilizzazione: acetone oppure miscela acetone-cloroformio 1 : 1.
• 5.6. Trigliceridi di riferimento: � possibile usare o trigliceridi commerciali (tripalmitina, trioleina ecc.) e, in questo caso, i tempi di ritenzione vengono portati in grafico in conformit� con il numero di carbonio equivalente oppure, alternativamente, � possibile ottenere un cromatogramma di riferimento dall'olio di soia (vedi note 3, 4 e figure 1 e 2).

6. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Una soluzione al 5 % dei campioni da analizzare viene preparata pesando 0,5 � 0,001 g del campione in un pallone graduato da 10 ml e portando a 10 ml con il solvente di solubilizzazione (5.5).

7. PROCEDIMENTO

• 7.1. Allestire il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (5.4) alla velocit� di 1,5 ml/mm in modo da pulire l'intero sistema. Aspettare finch� la linea di base rimane stabile. Iniettare 10 ml del campione preparato come al punto (6).
  
  

8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Usare il metodo di standardizzazione interno, cio� assumere che la somma delle aree dei picchi corrispondente ai vari trigliceridi sia eguale al 100 %. Calcolare la percentuale relativa di ciascun trigliceride usando la seguente formula:

% di trigliceride = (area del picco / somma delle aree dei picchi) * 100

esprimendo il risultato con una decimale.

• Nota 1: L'ordine di eluzione pu� essere determinato calcolando i numeri di carbonio equivalente, spesso definiti dalla relazione
  ECN = CN - 2n, dove CN � il numero di carbonio ed n � il numero di doppi legami; esso pu� essere calcolato pi� precisamente tenendo conto dell'origine del legame doppio. Se no, n1 e n1n sono i numeri di legami doppi attribuibili rispettivamente all'acido oleico, linoleico e linolenico, il numero di carbonio equivalente pu� essere calcolato mediante una relazione del tipo:
  

  ENC = CN - do no - d1n1 - d1nn1n

  dove i coefficienti do, d1 e d1n possono essere calcolati mediante i trigliceridi di riferimento. Nelle condizioni specificate nel presente metodo la relazione ottenuta sar� strettamente simile a:
  

  ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 n1] - [2,17 n1n]

• Nota 2: Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333; Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, o similari.
  
• Nota 3: Con parecchi trigliceridi di riferimento � possibile altres� calcolare la risoluzione rispetto alla trioleina, a = RT' / RT' di oleina usando il tempo di ritenzione corretto RT' = RT - RT solvente. Il grafico del log a in funzione di f (numero di doppi legami) consente di determinare i valori di ritenzione di tutti i trigliceridi di acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento - vedi figura 2.
  
• Nota 4: L'efficienza della colonna deve permettere la netta separazione del picco della LLL (trilinoleina) da quelli dei trigliceridi con Tr adiacente.
  
  

  Figura 1 Cromatogramma di un campione di olio di soia (un click sull'immagine per ingrandirla)

  Figura 2 Grafico del log a in funzione di f (numero di doppi legami) (un click sull'immagine per ingrandirla)